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Mag-Beads His-Tag蛋白纯化磁珠具有高效、快速、方便等特点，针对纯化His标签蛋白而研制的一种新型纯化材料，可通过特有的磁性分离方式直接从生物样品中一步纯化出高纯度的目标蛋白，极大地简化纯化工艺和提高纯化效率，适合科研和工业领域便捷地进行His-tag蛋白的纯化。

• 为了有利于纯化，按照下列操作步骤对磁珠进行预清洗，同时注意溶液中不能包含还原剂。
  
• 请在室温下操作，使用前温和的、充分的震荡，使磁珠保持均匀的悬浮状态。
  
• 磁珠保存过程中应避免冷冻/干燥和高速离心等操作，否则会破坏磁珠的结构，严重影响蛋白结合能力。
  
• 使用过的磁珠重复使用时，建议纯化同一种的蛋白，纯化不同种蛋白时，建议使用新的磁珠，以避免交叉污染。

• Buffer在使用前需用0.22或者0.45μm滤膜过滤除菌。
  
• A推荐的Buffer体系适用于多数组氨酸标签蛋白的纯化，在Binding Buffer中添加一定浓度的咪唑可以降低非特异性结合，提高目的蛋白的纯度。初次使用的客户可以采用推荐的缓冲液，再根据实验结果适当调整缓冲液中的咪唑浓度。
  
• 包涵体His标签蛋白纯化时如果洗杂洗脱效果不好，可以降低Wash Buffer及Elution Buffer的PH值进行差异洗脱。

• 可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
  Binding Buffer：20mM Phosphate Buffer,500mM NaCl,5～50mM Imidazole,pH7.4。
  Wash Buffer：20mM Phosphate Buffer,500mM NaCl,50～100mM Imidazole,pH7.4。
  Elution Buffer：20mM Phosphate Buffer,500mM NaCl,500mM Imidazole,pH7.4。
  
• 包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
  Binding Buffer：8M Urea,50mM NaH2PO4,5～50mM Imidazole,100mM Tris·Cl,pH8.0。
  Wash Buffer：8M Urea,50mM NaH2PO4,50～100mM Imidazole,100mM Tris·Cl,pH8.0。
  Elution Buffer：8M Urea,50mM NaH2PO4,500mM Imidazole,100mM Tris·Cl,pH8.0。

• 组氨酸标签蛋白样品准备(在大肠杆菌下非变性条件下可溶性表达)
  稀释重组表达的：每克大肠杆菌菌体加入5～10mL binding buffer重悬。样品和binding buffer含同样浓度的咪唑可以避免宿主细胞表达的含组氨酸的蛋白。同时要去除大颗粒和高浓度的螯合剂，如EDTA，组氨酸、柠檬酸等杂质，防止破坏NiNTA树脂。
  
  • 酶解：0.2mg/mL溶菌酶，20μg/mL DNase，1mM MgCl₂，1mM PMSF(终浓度)或其他蛋白酶抑制剂。加入的抑制剂必须对磁珠没有影响，4℃混匀30分钟。
    
  • 机械裂解：超声，均质，反复冻融等。
    
  • 调整裂解液的pH到7.4：不要用强碱或酸调节pH(防止沉淀)。
    
  • 裂解液离心：将液体转移到离心管中在室温或4℃ 12,000rmp离心20min，温度的选择取决于蛋白的稳定性。
    
  • 收集上清准备进行后续实验，或是收集离心后的沉淀准备下一步实验。
    
  • 对于在酵母、昆虫及哺乳动物细胞系统中表达的蛋白，如果有大量的上清液可以用硫酸铵进行蛋白沉淀。用1X PBS透析，加入到柱中，如果样品中不含EDTA，组氨酸，柠檬酸等影响柱子的成分，可以直接上柱。在细胞质表达的试剂盒，请用其他试剂或试剂盒(GS1535昆虫细胞蛋白裂解液，GS1420动物细胞蛋白裂解液，GS1423酵母蛋白裂解液)或查阅其他的相关文献。然后将提取的蛋白与5倍量的Binding/Wash buffer混合。其他的Buffer可以使用，但要根据经验确定。
• 组氨酸标签蛋白样品准备(在大肠杆菌中包涵体表达变性条件纯化)
  
  • 用1X PBS悬浮细胞(每ml细菌沉淀约5mL 1X PBS)，按照上面的超声条件进行实验。
    
  • 裂解液在12000rpm离心10min收集包涵体。用1X PBS洗涤几次包涵体。
    
  • 用Binding/Wash buffer溶解包涵体(每ml包涵体约5mL Buffer)，并在室温下孵育30～60min。可能需要均质或超声将沉淀完全溶解。
    
  • 12000rpm离心30min去除剩余的不溶物。小心的将上清转移到干净的管中而不触碰下面的沉淀。

• 磁珠准备：将Ni-NTA纯化磁珠充分混匀，使用移液器取5mL的磁珠悬浮液，(磁珠体积500μL)置于离心管中，将离心管置于磁分离器上，待溶液变澄清后，用移液器吸弃清液，加入去离子水反复清洗，去除酒精。
  
• 磁珠平衡：加入5mL的Binding Buffer，使用枪头反复吹打5～10次，将离心管置于磁分离器上，待溶液变澄清后，用移液器吸弃清液，重复洗涤2次。
  
• 磁珠与目的蛋白结合：用10mL Binding Buffer悬浮2g湿重菌体，进行破损和裂解后，即为目的粗蛋白样品，将粗蛋白破碎液加入到处理好的磁珠中，颠倒混匀。室温孵育30min(如果目标蛋白不稳定，建议置于2～8℃下孵育1h)。
  
• 洗杂：将离心管置于磁分离器，待溶液变澄清后，用移液器移出上清液，保留流穿液，以备取样检测。向离心管中加入10mL Wash Buffer，使用枪头反复吹打5～10次，将离心管置于磁分离器上，待溶液变澄清后，用移液器吸取上清液，保留洗杂液，以备取样检测。重复洗杂步骤3次以上。
  
• 洗脱：用户可根据需要改变洗脱体积调整目标蛋白浓度，加入2～10mL Elution Buffer加入到离心管中，使用移液器轻轻吹打3～5次，混匀，将离心管置于磁分离器上，待溶液变澄清后，用移液器吸取上清液，即为目的蛋白组分。重复上述步骤多次，分别收集洗脱组分并留样检测，以提高目的蛋白的回收量。
  
• 磁珠后处理：加入5mL Elution Buffer，用移液器反复吹打3～5次，使磁珠充分悬浮，然后置于磁分离器，吸弃上清，重复该步骤2次。再用5mL去离子水反复清洗3～5次。最后，加入5mL 20%的乙醇溶液，使总体积等于初始磁珠悬浮液的体积，保存于2～8℃。
  
• SDS-PAGE检测：将纯化所得样品用SDS-PAGE检测，收集含有目的蛋白的组分。
  
• 在位清洗(CIP)：1M NaOH清洗6～8倍体积，之后用70%乙醇清洗6～8倍体积，再用ddH2O清洗10倍体积，最后再用Binding Buffer清洗4倍体积后上样。
  
• 磁珠再生：磁珠连续使用三次以上，其结合目标蛋白的能力可能会明显降低，建议进行磁珠再生处理。
  Stripping Buffer:20mM Sodium Phosphate,500mM NaCl,100mM EDTA,pH7.4。
  Washing Buffer(可选):0.5M NaOH,2M NaCl。
  Recharge Buffer:100mM NiSO4 (该化学试剂有一定的毒性，可能造成过敏反应，使用时务必注意)。
  以5mL 10%(v/v)磁珠悬液为例，详细说明磁珠再生操作：
  
  • 将磁珠悬液进行磁性分离，去除上清液，从磁性分离器上取下离心管，在离心管中加入5mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。
    
  • 加入5mL Stripping Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合5min，磁性分离，去除上清液。重复此步骤1次。
    
  • 加入5mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液，重复此步骤2次。
    
  • 碱处理：加入5mL Washing Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合5min，磁性分离，去除上清液。加入5mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。重复ddH2O洗涤步骤3～5次，至洗涤液呈中性为止。
    
  • 加入5mL Recharge Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合20min，磁性分离，去除上清液。
    
  • 加入5mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。重复此步骤4次以上，保证镍离子去除完全。
    
  • 加入5mL 20%的乙醇溶液，使总体积等于初始磁珠悬浮液的体积，保存于2～8℃。

• 磁珠使用和保存过程中应避免冷冻、干燥和高速离心等操作；
  
• 在使用本制品前，请务必充分振荡使磁珠保持均匀的悬浮状态；
  
• 磁珠与溶液混合过程中，如果溶液粘稠无法通过翻转离心管重悬磁珠，可采用移液器反复吹吸或短时漩涡混合使磁珠充分重悬；
  
• 用户可根据实际需要保留经磁性分离移去的上清液，进行取样检测，以便分析纯化过程和优化蛋白纯化流程；
  
• 本制品可以重复使用，重复使用时，建议纯化同种蛋白，纯化不同种类的蛋白时，建议使用新的磁珠，以防交叉污染；
  
• 本制品需与磁性分离器配套使用；
  
• 本试剂盒只能够用于体外实验，不能够用于临床、治疗和动物体内实验等，由此产生的后果概不承担责任。